DETEKSI BAKTERIOFAG

PRAKTIKUM 19

“DETEKSI BAKTERIOFAG”

19.1 Tujuan: Untuk mendeteksi coliphages di air limbah.

1.      Teteskan bakteri pada sampel air atau limbah.

2.      Meneteskan bakteri selama 24-48 jam.

3.      Menghitung jumlah virus plak yang terdapat di bakteri.

4.      Menjumlahkan coliphage dalam sampel.

19.2 LANDASAN TEORI

Virus adalah ultramicroscopic atau sesuatu yang terlalu kecil untuk dilihat dengan menggunakan mikroskop cahaya, hanya dapat terlihat dengan resolusi lebih besar yaitu dengan mikroskop elektron. Virus merupakan partikulat, bukan selular, maupun lebih atau kurangnya makromolekul yang terdiri dari genom asam nukleat, DNA atau RNA, dan protein. Virus menarik parasit intraselular yaitu asam nukleat genom kontrol dan memanfaatkan kapasitas sintetis mereka sel inang untuk replikasi.

Virus dapat menginfeksi saluran usus manusia dan hewan yang dikenal sebagai virus enterik. Virus dikeluarkan dalam bentuk tinja dan dapat diisolasi dari limbah domestik. Virus yang menginfeksi bakteri dikenal sebagai Bacteriofag, sedangkan virus yang menginfeksi bakteri coliform disebut coliphage. FAG dari bakteri coliform dapat  ditemukan di mana saja.

Pada dasarnya, partikel virus, atau virion, adalah inti asam nukleat yang dikelilingi oleh mantel protein, atau kapsid yang terdiri dari protein subunit atau capsomers. Di beberapa virus yang lebih kompleks, nukleokapsid dikelilingi oleh amplop tambahan dan memiliki spike seperti pelengkap permukaan atau ekor. Konsentrasi virus pada manusia di limbah berkisar dari 103–107 L-1. Konsentrasi coliphages di limbah berkisar 10-100 per ml.

-Inang pendeteksi organisme (koliform tinja) -Air dan efisiensi pengolahan air limbah -Lingkungan enterik virus -Gerakan air pada permukaan dan dasar air -Limbah kotoran domestik -Patogen

Tabel 19.1 Aplikasi potensial dari bakteriofag sebagai indikator kualitas lingkungan hidup

Beberapa coliphage memiliki struktur kompleks yang terdiri dari kepala (kapsid), yang berisi inti asam nukleat, ekor, dan ekor serat yang membantu FAG menempel ke bakteri (misalnya, T phages, lihat gambar 19.1). Phages lain terdiri hanya dari kapsid dan asam nukleat dan menempel ke pili seks bakteri jantan (bacteriophages khusus, misalnya, FAG MS-2).

Ada banyak fungsi dari bacteriophages sebagai indikator lingkungan (tabel 19 - 1). Ini digunakan sebagai indikator dari limbah yang terkontaminasi, efisiensi air dan pengolahan air limbah, dan kelangsungan hidup enterik virus dan bakteri dalam lingkungan. Penggunaan bacteriophages sebagai indikator hadirat dan sifat bakteri dan virus hewan selalu menarik karena kemudahan deteksi dan murah bila dikaitkan dengan FAG tes. Selain itu, mereka dapat diukur dalam sampel lingkungan dalam waktu 24 jam lebih cepat dibandingkan dengan hari atau minggu untuk virus enterik. Coliphages adalah yang paling sering digunakan dalam konteks ini meskipun bacteriophages dan cyanophages (yaitu, virus dari ganggang biru - hijau) lainnya juga telah dipelajari. Banyak studi perilaku coliphage di alam telah memperoleh wawasan tentang virus enterik patogen pada manusia. Akibatnya, lebih sering dikenal dengan ekologi coliphage daripada kelompok Bacteriofag lainnya.

Coliphages dalam air yang diuji dengan penambahan sampel atau permukaan agar dengan budaya E. coli dalam log tahap pertumbuhan. FAG melekatkan ke sel bakteri dan melisiskan bakteri. Bakteri menghasilkan pertumbuhan rumput confluent kecuali untuk daerah di mana FAG telah berkembang dan bakteri lysed. Tampak jelas dihasilkan atau dikenal sebagai plak. Hamparan lembut agar-agar digunakan untuk meningkatkan fisik penyebaran virus antara sel-sel bakterial.

Bakteri dalam log tahap pertumbuhan sangat berperan untuk mendapatkan pembentukan plak optimal. Hal ini memastikan bahwa semua FAG melekat pada bakteri hidup dan menghasilkan keturunan. Hal ini memerlukan budaya bakteri host disiapkan setiap hari. Biasanya dengan diinkubasi sehari sebelum tes untuk mendapatkan dalam fase stasioner. Hal ini kemudian digunakan untuk berpikir innoculate kaldu yang diinkubasi untuk mendapatkan cukup host bakteri dalam tahap log untuk assay (ini biasanya membutuhkan 2-3 jam inkubasi dalam penangas air pada suhu 35 sampai 37°C).

19.3 LANGKAH KERJA

TAHAPAN PERTAMA

Bahan-bahan:

·         limbah 1,0 ml (mentah atau non-didesinfeksi diperlakukan limbah) atau air sampel yang mengandung coliphage

·         3-4h hara kaldu  E. Coli

·         2 tabung berisi 9 ml Tris-buffered saline (Tris penyangga atau saline lain buffered)

·         4 tabung 3 ml setiap lembut (atas) agar (0.7% hara kedelai agar atau trypticase)

·         4 cawan Petri dengan bawah agar (10-12 ml) (hara agar atau trypticase kedelai)

·         6 pipet ukuran 1 ml

·         Pipet bulb

·         Penangas air pada 45-48 C

·         Kertas saring

·         Incubator 37 C

Gambar 19.2 Prosedur untuk persiapan rumput bakteri di lapisan atas agar ketika deteksi coliphage berlangsung.

1)      Persiapan bagian atas agar.

(a) penyuntikan bagian atas agar-agar dengan sel bakteri

Bacterial cells

(b) penyuntikan bagian atas agar dengan phage (FAG)

Suspensi FAG

2)      penyepuhan dan deteksi

(a) menuangkan campuran ke tempat nutrisi agar-agar

Permukaan bawah agar

Cairan atas agar-agar

Incubation

Penyuntikan cairan atas agar dengan bakteri

(b) plak FAG yang terdeteksi rumput bakteri

permukaan sel-sel bakteri

1. Sampel dari limbah atau air yang mengandung coliphage akan disediakan oleh instruktur.

2. Encerkan  sampel dengan perbandingan  1:10 dan 1:100 dengan membuat pengenceran 10 fold di Tris buffer dengan mentransfer 1,0 ml untuk 9 ml Tris buffer.

3. Lelehkan empat tabung agar yang lembut  (0,7% agar per 3 ml tabung) dengan menempatkan dalam uap atau autoclaving. Tempatkan agar-agar dalam penangas air pada suhu 45-48 C dan biarkan 15 menit  untuk suhu agar-agar  pada 45 C.

 4. Untuk tabung pertama tambahkan 1 ml log fase kaldu  E. coli[1] dan 1 ml sample murni. Bersihkan  tabung dari air bak  dengan batu kerikil antara tangan Anda untuk campuran suspensi selama 2-3 detik. Penghapusan air dari tabung dengan kertas saring  dan tuangkan Petri yang mengandung bawah agar-agar. Cepat balikkan piring untuk menyebarkan bagian atas agar-agar. Pastikan agar meliputi seluruh permukaan.

5. Ulangi langkah 4 menggunakan 1 ml bakteri dan 1 ml setiap pengenceran FAG. Lihat gambar 19.2

Gambar 19.3 bakteri pada plak FAG.(Photo courtesy  K.L. Josephson.)

6.      Setelah agar-agar telah dipadatkan, invert cawan petri dan menetaskan di 37 C untuk 24 h. Knock kelembaban pun off tutup piring Petri. Jika penurunan kelembaban jatuh pada plak akan menyebabkan itu menyebar di seluruh permukaan agar.

TAHAPAN KEDUA

Bahan: diinkubasi dari cawan petri tahap pertama.

1. hitunglah jumlah plak pada setiap pengenceran (gambar 19-3) dan jumlahkan konsentrasi FAG dengan sampel yang asli.

2. amati perbedaan besar dalam ukuran atau saat munculnya plak.

19.4 TRIK PERDAGANGAN.

Lakukan:

·         bakteri harus berada dalam tahap log pertumbuhan untuk pembentukan plak FAG optimal. Ini berarti bahwa budaya baru harus tumbuh di bawah yang ditetapkan dengan kondisi (suhu, gemetar atau non-gemetar) setiap kali.

·         Pastikan untuk kocok tabung yang mengandung overlay agar untuk mendapatkan hasil lebih banyak keluar dari tabung sebanyak mungkin.

Dilarang:

·         Tidak diizinkan bakteri dan FAG dalam air bak terlalu lama (tidak lebih dari 1-2 menit) atau bakteri akan musnah oleh panas.

·         tidak diizinkan agar-agar cair untuk mengatur dalam penangas air 45 C selama lebih dari 1-2 jam ketika air menguap menyebabkan benjolan agar untuk membentuk.

19.5 BAHAYA POTENSIAL.

Lakukan:

·         Ingat jika Anda menangani limbah, hal itu mungkin mengandung patogen. Lakukanlah dengan hati-hati.

19.6 RUMUSAN MASALAH

1. adakah beberapa faktor yang mungkin menentukan ukuran plak?

2. Mengapa kita menggunakan bakteri dalam log fase pertumbuhan untuk percobaan ini?

3. Apa saja yang merupakan sumber coliphage di lingkungan?

4. Apakah coliphage merupakan potensi indikator? Mengapa?

5. Bagaimana sebuah plakat diproduksi pada rumput bakteri?

19.7 REFERENSI

Bitton, G. (1998) Wastewater Microbiology, 2nd edition. Wiley-Liss, New York.

Goyal, S.M., Gerba, C.P., and Bitton, G. (1987) Phage Ecology. John Wiley & Sons, New York.

IAWPRC Study  Group (1991)  Bacteriophages as model  viruses  in water quality control. Water Research 5, 529–546.

---

[1] Strain e. coli ATCC 15597 biasanya akan menghasilkan jumlah terbesar plak dari sampel limbah. Sebuah koloni E. coli ATCC 15597 diinokulasi ke dalam 3 ml trypticase kedelai kaldu dan incu - tertahan semalam di 35 C. 3 Jam sebelum assay FAG menyuntik 1 ml budaya ini ke dalam labu segar yang mengandung 100 ml gizi atau trypticase kedelai kaldu dan tempat di waterbath gemetar di 35 C untuk 37 C. Diinkubasi selama 3 jam. Ini akan memastikan bahwa bakteri berada dalam  fase pertumbuhan.